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2023-01-122999 次瀏覽
小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞定株簡(jiǎn)要流程

實(shí)驗(yàn)材料:

DMEM高糖培養(yǎng)基                     

FBS/NBS                            

HT選擇培養(yǎng)基                       

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱

細(xì)胞計(jì)數(shù)器                         

單通道移液槍、多通道移液槍

相差顯微鏡                         

生物安全柜

10μL、200μL1000μL吸頭 

96/24/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板       

15mL、50mL無菌離心管       

100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿           

T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶             

96孔酶標(biāo)板                

 

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:

陽性對(duì)照:

融合前采對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)的小鼠眼球血,37℃放置2h,然后4℃放置2h,最后10000rpm離心10min,取上清,-20℃條件下保存。(使用前提前解凍,稀釋1000倍備用)

陰性對(duì)照:

各個(gè)階段培養(yǎng)基留5ml左右,作為陰性對(duì)照用。

Elisa檢測(cè)板準(zhǔn)備:

將對(duì)應(yīng)抗原用CB1μg/ml濃度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)(100μl/孔),4℃過夜靜置包被。用1×PBST洗板2遍,清洗結(jié)束,加入封閉液封閉,37℃封閉1h,用1×PBST洗板2遍,拍干水分,4℃短期保存,-20℃長(zhǎng)期保存。

 

實(shí)驗(yàn)流程:

融合檢測(cè)

細(xì)胞融合換液后,等4~7天,觀察細(xì)胞融合狀態(tài),大部分細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)出現(xiàn)小細(xì)胞團(tuán),即可開始檢測(cè)。

用排槍取融合培養(yǎng)上清100μL/孔至包被好的Elisa檢測(cè)板中,因?yàn)?span lang="EN-US">Elisa檢測(cè)板來源于外部,切記從細(xì)胞培養(yǎng)板中單次取液,不可反復(fù)吸取,取一次液換一次槍頭,防止污染細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞,以及交叉污染影響檢測(cè)結(jié)果。(每塊板預(yù)留一孔陽性對(duì)照孔,一孔陰性培養(yǎng)基對(duì)照孔)

根據(jù)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的OD值,確定陽性孔,取陽性對(duì)照OD值得一半以上的數(shù)值為陽性。

 

第一次亞克?。?/span>

根據(jù)融合檢測(cè)的數(shù)據(jù),挑選陽性孔,將陽性孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)擴(kuò)增,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況2~3天后采用Elisa方法復(fù)檢,防止假陽性。

挑選24孔板中復(fù)檢陽性的孔,進(jìn)行細(xì)胞復(fù)懸,使細(xì)胞在培養(yǎng)基中分散均勻。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)完成后,根據(jù)計(jì)數(shù)情況比例稀釋細(xì)胞懸液,按照1個(gè)/孔的密度均勻鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,一個(gè)陽性克隆株鋪一塊細(xì)胞培養(yǎng)板板。[一次亞克隆采用FBS-DMEM(HT),培養(yǎng)基的血清使用濃度略低于融合時(shí)的濃度,略高于SP2/0常規(guī)培養(yǎng)濃度,可按照5% 進(jìn)行區(qū)分]

 

畫克?。?span lang="EN-US">

一次亞克隆后,融合細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~5天后,采用相差顯微鏡逐孔觀察,在單孔內(nèi)有且只有一個(gè)正圓形細(xì)胞團(tuán)的孔,即為單克隆細(xì)胞孔,做好標(biāo)記。若無無單克隆孔,則挑選細(xì)胞團(tuán)較少的多克隆細(xì)胞孔,做好標(biāo)記。

 

一次亞克隆檢測(cè):

畫克隆后,繼續(xù)培養(yǎng)3~5天,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,采用Elisa法進(jìn)行一次亞克隆檢測(cè),優(yōu)選挑選陽性單克隆孔,若無陽性單克隆孔,則挑選克隆數(shù)較少的陽性多克隆孔。挑選出來的細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至24孔擴(kuò)增培養(yǎng),進(jìn)行陽性克隆株復(fù)篩,確保挑選的細(xì)胞株非假陽性。

 

二次亞克?。?span lang="EN-US">

將一次亞克隆挑選出來的細(xì)胞株,重復(fù)一次亞克隆步驟。細(xì)胞培養(yǎng)基換成FBS-DMEM,培養(yǎng)基的血清使用濃度調(diào)整成SP2/0的常規(guī)培養(yǎng)濃度。

 

畫克隆

二次亞克隆后4~5天,進(jìn)行畫克隆,單克隆孔做好標(biāo)記。

 

二次亞克隆檢測(cè):

畫克隆后,繼續(xù)培養(yǎng)3~5天,重復(fù)一次亞克隆檢測(cè)步驟,挑選陽性單克隆細(xì)胞株,準(zhǔn)備進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

 

建株:

陽性單克隆細(xì)胞株需進(jìn)行至少2次的亞克隆,檢測(cè)為全陽方可建株!若為了保證穩(wěn)定性,建議進(jìn)行第三次亞克隆。

挑出兩次檢測(cè)均為單克隆且全為陽性后,在24孔板中培養(yǎng)擴(kuò)增,2~3天后用Elisa法進(jìn)行交叉檢測(cè)(主要針對(duì)帶標(biāo)簽的蛋白抗原)和穩(wěn)定性鑒定。

檢測(cè)合格后挑選一個(gè)細(xì)胞狀態(tài),長(zhǎng)勢(shì)較好且陽性OD值較高的細(xì)胞株,轉(zhuǎn)移至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增,2~3天后,用亞型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定。

完成以上鑒定后,將單克隆細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至100m細(xì)胞培養(yǎng)皿或者T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行大量擴(kuò)增。

擴(kuò)增完成后將單克隆細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞凍存,標(biāo)記好細(xì)胞名稱、凍存者、凍存日期等信息,放置凍存盒中,轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱,一天后轉(zhuǎn)移至液氮罐中儲(chǔ)存。

凍存后一周再?gòu)?fù)蘇檢測(cè),防止細(xì)胞株出現(xiàn)產(chǎn)抗不穩(wěn)定現(xiàn)象,若檢測(cè)沒有問題,則將細(xì)胞株錄入細(xì)胞庫中,并撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。(細(xì)胞凍存3/株,且3支確保有2個(gè)及以上凍存批次,避免出現(xiàn)凍存失誤,細(xì)胞株丟失)

 

使用到的NEST產(chǎn)品:

10μL、200μL、1000μL吸頭 

96/24/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板        

15mL、50mL無菌離心管      

100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿            

T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶              

96孔酶標(biāo)板