定義:
動物細胞融合是指兩個或者多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。融合后形成具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞,稱為雜交瘤細胞。
動物細胞融合通常有物理法(電刺激)、化學法(聚乙二醇)、生物法(滅活病毒)三種方法。
而雜交瘤細胞是由經(jīng)免疫的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合而成的,既有無限增殖能力又能產(chǎn)生特定抗體能力的細胞。
實驗材料:
DMEM高糖培養(yǎng)基
FBS/NBS
生物安全柜
滅菌手術(shù)剪刀、鑷子
HAT或HT選擇培養(yǎng)基
CO2細胞培養(yǎng)箱
雙抗(青鏈霉素混合液)
低速離心機
15mL、50mL無菌離心管
96孔細胞培養(yǎng)板
100mm細胞培養(yǎng)皿
單通道移液槍、多通道移液槍
200μL、1000μL吸頭
倒置相差顯微鏡
220目(70μm)細胞篩
5mL一次性無菌注射器
實驗準備:
飼養(yǎng)細胞:
融合前一天,取符合免疫質(zhì)控標準的Balb/c小鼠,脫頸處死并泡在75%酒精中消毒。
用手術(shù)剪刀輕輕剪開老鼠的腹部皮膚。(注意請勿破壞小鼠的腹膜)
取10mL DMEM培養(yǎng)基在50mL無菌離心管中, 5mL注射器吸取3~5mL培養(yǎng)基,用手術(shù)鑷子提起小鼠腹膜,將5ml培養(yǎng)基打入老鼠腹部,反復吹打3-4次后將培養(yǎng)基回收,置于50ml無菌離心管中。再次吸取5ml培養(yǎng)基,重復此步驟。
在無菌條件下取出小鼠脾臟,用研磨器研磨脾臟,與DMEM混合過篩網(wǎng)制成單個脾細胞懸液,再與腹腔細胞懸液混合,低速離心(1000rpm*10min),棄上清。
使用HAT培養(yǎng)基重懸,制成飼養(yǎng)細胞懸液,可按照105/孔使用,均勻鋪96孔板,每孔100μL。(在制備過程中嚴格保證無菌)
SP2/0準備:
SP2/0細胞在融合前4—5天復蘇,培養(yǎng)換液,使細胞在融合前狀態(tài)良好且處于對數(shù)增長期。
試劑準備:
取1mL/管50% PEG1450一支,DMEM,FBS-DMEM,FBS-DMEM(HAT)等試劑,均預熱置37℃
實驗流程:
SP2/0收集:
SP2/0低速離心(1000rpm*5min),棄上清,用DMEM復懸清洗,再重復一次此步驟,37℃復懸備用。
脾細胞懸液制備:
取免疫完成的小鼠,眼球取血后,浸潤在75%的酒精中消毒滅菌。在無菌條件下取出其脾臟,使用研磨器研磨脾臟,與DMEM混合過篩網(wǎng)制成單個脾細胞懸液,低速離心(1000rpm*10min),棄上清,用DMEM清洗并再一次重復此步驟,37℃復懸備用。
細胞融合:
將脾細胞和SP2/0按照[脾細胞:SP2/0 = 2:1~3:1]的比例,混合于50ml離心管中低速離心(1000rpm*10min),棄上清且確保管內(nèi)無液體殘留,將細胞團塊輕輕敲散,使脾細胞
& SP2/0在管底均勻混合鋪開。加入預熱完成的50% PEG1450 ,在1min內(nèi)逐滴均勻加入,加完后37℃反應(yīng)1min,反應(yīng)完成后加入10~15ml左右終止液(DMEM)終止反應(yīng),由慢至快逐步滴加,10min全部加入完成。
融合鋪板:
細胞融合完成后,低速離心(1000rpm*10min),棄上清,使用FBS-DMEM(HAT)復懸細胞制成細胞懸液,(過程中注意動作輕柔,不可用力吹打,以免破壞融合細胞降低融合率)。將提前一天已加入飼養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)板取出,用吸頭將板內(nèi)培養(yǎng)基上清全部吸出丟棄,將剛制備完成的細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中,每孔200μL,轉(zhuǎn)入5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。
融合換液:
融合細胞在FBS-DMEM(HAT)中培養(yǎng)3~7天,根據(jù)細胞融合情況,將培養(yǎng)上清吸出丟棄,更換成FBS-DMEM(HT),每孔200μL。換液后觀察細胞形態(tài),根據(jù)細胞生長情況,在4~7天后用Elisa進行融合陽性篩選檢測。
使用到的NEST產(chǎn)品:
15mL、50mL無菌離心管
96孔細胞培養(yǎng)板
100mm細胞培養(yǎng)皿
220目(70μm)細胞篩
200μL、1000μL吸頭