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2023-02-013500 次瀏覽
細(xì)胞凍存

實(shí)驗(yàn)材料:

基礎(chǔ)培養(yǎng)基                          

血清(常規(guī)為FBS/NBS                           

無菌PBS磷酸鹽緩沖液                

電動(dòng)移液槍

移液槍                              

超凈工作臺(tái)                             

無菌二甲基亞砜(DMSO

針式濾器 (0.22μm PES) [NEST]

杯式濾器(0.22μm PES) [NEST]

15mL、50mL無菌離心管[NEST]

程序降溫盒[NEST]

PET/PETG方形試劑瓶[NEST]

移液管[NEST]

自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]

盒裝無菌吸頭[NEST]

 

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:

凍存液準(zhǔn)備:

一般的細(xì)胞:55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%牛血清(FBS/NBS+5%DMSO

重要的細(xì)胞:90%牛血清(FBS/NBS+10%DMSO

凍存液配置完成后,15ml離心管分裝,4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。若配置量較大,可分裝入50ml離心管,-20℃條件下冷凍儲(chǔ)存。(若牛血清內(nèi)存在析出沉淀物,采用0.22μm 濾膜過濾除菌)

使用前37℃水浴加熱

待凍存細(xì)胞:

使細(xì)胞凍存前,選擇細(xì)胞生長狀態(tài)良好,且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,凍存前12~24h換新鮮培養(yǎng)基維持細(xì)胞狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)流程:

觀察待凍存細(xì)胞密度,約為80%~90%。用移液槍吸出陳舊培養(yǎng)基,加入無菌PBS清洗細(xì)胞1-2次,去除培養(yǎng)環(huán)境中的殘留培養(yǎng)基。

加入適量對應(yīng)胰酶或消化液,使胰酶沒過細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱消化。顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間不再連接成片,此時(shí)加入完終止液終止消化。

用吸頭輕輕吹打細(xì)胞,形成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液1000rpm,離心3-5min。丟棄上清,加入適量預(yù)先配制好的凍存液,輕輕吹打使細(xì)胞均勻并計(jì)數(shù)。用凍存液調(diào)節(jié)的細(xì)胞密度,使之終密度為5×106/ml1×107/ml。

用移液槍按照預(yù)計(jì)容量,分裝入細(xì)胞凍存管[NEST]中,采用自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]旋蓋密封。

標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾蕸r處-1℃~-2/ min,可將待凍存細(xì)胞按照以下步驟逐步凍存:室溫→4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(過夜)→液氮長期保存。

也可將待凍存放入程序降溫盒[NEST],直接-80℃過夜,再轉(zhuǎn)移至液氮保存。

 

使用到的NEST產(chǎn)品:

無菌二甲基亞砜(DMSO

針式濾器 (0.22μm PES) [NEST]

杯式濾器(0.22μm PES) [NEST]

15mL50mL無菌離心管[NEST]

程序降溫盒[NEST]

PET/PETG方形試劑瓶[NEST]

移液管[NEST]

自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]

盒裝無菌吸頭[NEST]

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