PBMC(peripheral
blood mononuclear cell),外周血單個核細(xì)胞,其主要細(xì)胞類型為血液里具有單個核的細(xì)胞,主要包括淋巴細(xì)胞(T\B),單核細(xì)胞,吞噬細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞和其他少量細(xì)胞類型,其中淋巴細(xì)胞占很大一部分。分離PBMC的主要目的是為了將多核細(xì)胞和紅細(xì)胞去除,從而能夠很方便地模擬體外的血液免疫環(huán)境。從血液制備PBMC是分離特定免疫細(xì)胞亞群之前常見的一個步驟。最常用的PBMC分選方法是使用密度梯度離心液進(jìn)行離心。
工具/原料
方法/步驟
1. 將分離液用移液管從分離管嵌套的中心孔中加入:15ml的分離管需要加入約4ml分離液;50ml的分離管需要加入約13ml分離液,確保分離液覆蓋嵌套上方。
2. 將抗凝樣本沿管壁緩慢倒入或用移液管沿管壁緩慢加入到分離管中。
3. 室溫下離心10min,離心力為1200 x g。
4. 收獲PBMC細(xì)胞,將分離管中上清倒入另一干凈離心管中,分離管中的嵌套能有效避免紅細(xì)胞和粒細(xì)胞再次污染。(注意:離心后傾倒收獲細(xì)胞前,也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層,有助于減少細(xì)胞被血小板污染。)
5. 用PBS洗滌PBMC細(xì)胞,在250 x g離心力下離心10min。
6. 按步驟5重復(fù)洗滌2次,用5ml PBS緩沖液重懸細(xì)胞。
離心后液體分離情況(從上到下):a血漿層;b富集的細(xì)胞部分(PBMCs);c分離液;d嵌套;e沉淀(紅細(xì)胞和粒細(xì)胞)。
注意事項
1. 可用于人類外周血、骨髓和臍帶血樣本。不適用于血凝等異常樣本或超過48小時的樣本。
2. 15ml的分離管建議使用4-9ml樣本;50ml的分離管建議使用13-30ml樣本。
3. 對于放置24h以上的樣本,建議離心時間加長。
4. 離心后收獲細(xì)胞前,也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層,有助于防止被血小板污染。
5. 離心后傾倒上清時不要將分離管倒置2s以上。
6. 分離管請勿重復(fù)使用。
7. 離心后,細(xì)胞可能聚集在富集層以上的分離管的管壁上。這種聚合是正常的,受樣本質(zhì)量、樣本放置時間和抗凝劑類型的影響。此聚合與分離管的使用無關(guān)。細(xì)胞可以通過使用移液管尖端輕刮聚集團(tuán)的一側(cè)來清除。